目錄
目錄 I
摘要 III
Abstract V
第一章 文獻(xiàn)綜述 - 1 -
1.1 表皮生長(zhǎng)因子及其家族 - 1 -
1.1.1表皮生長(zhǎng)因子理化性質(zhì) - 1 -
1.1.2 EGF的生理功能及應(yīng)用 - 3 -
1.1.3 EGF生理功能的作用機(jī)制 - 4 -
1.1.4 EGF家族成員及其結(jié)構(gòu)與功能特性 - 7 -
1.2 EGF受體（EGFR）的生理特性及其研究進(jìn)展 - 7 -
1.2.1 EGFR的生理特性及信號(hào)傳導(dǎo)途徑 - 7 -
1.2.2 EGFR在癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療中作用的研究現(xiàn)狀 - 9 -
1.3 本研究的方法與技術(shù) - 12 -
1.3.1 本研究的技術(shù)路線 - 12 -
1.3.2 定向進(jìn)化技術(shù)及本研究采用的改組策略 - 12 -
1.3.3 噬菌體展示高通量篩選技術(shù) - 16 -
1.3.4 圓二色譜技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 - 18 -
第二章 EGF定向突變文庫(kù)的構(gòu)建 - 22 -
2.1 材料與方法 - 22 -
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 - 22 -
2.1.2 方法 - 24 -
2.2 結(jié)果與分析 - 28 -
2.2.1 易錯(cuò)PCR誘變hEGF與pEGF - 28 -
2.2.2 StEP重組文庫(kù)的建立 - 30 -
2.3 討論 - 31 -
2.3.1 進(jìn)化親本的選擇 - 31 -
2.3.2 易錯(cuò)PCR條件的優(yōu)化 - 32 -
2.3.3 StEP條件的選擇 - 33 -
2.4 小結(jié) - 34 -
第三章 突變文庫(kù)的親和性篩選及陽(yáng)性克隆的表達(dá)、純化及活性檢測(cè) - 35 -
3.1 材料與方法 - 35 -
3.1.1實(shí)驗(yàn)材料 - 35 -
3.1.2 方法 - 38 -
3.2 結(jié)果與分析 - 43 -
3.2.1 噬菌體表面展示文庫(kù)的建立 - 43 -
3.2.2 噬菌體展示文庫(kù)的淘洗篩選 - 44 -
3.2.2 細(xì)胞ELISA篩選淘洗后文庫(kù) - 44 -
3.3 討論 - 45 -
3.3.1 細(xì)胞表面噬菌體展示文庫(kù)的篩選 - 45 -
3.3.2 ELISA方法的選擇 - 47 -
3.4 小結(jié) - 48 -
第四章 噬菌體展示陽(yáng)性克隆的表達(dá)與活性檢測(cè) - 49 -
4.1 材料與方法 - 49 -
4.1.1實(shí)驗(yàn)材料 - 49 -
4.1.2 方法 - 51 -
4.2 結(jié)果與分析 - 56 -
4.2.1 陽(yáng)性克隆表達(dá)載體的構(gòu)建 - 56 -
4.2.2 重組EGF的表達(dá)及純化 - 57 -
4.2.3 MTT分析重組蛋白活性 - 58 -
4.2.4 重組子序列的測(cè)定分析 - 58 -
4.2.5 EGF E40V表達(dá)條件的優(yōu)化 - 59 -
4.2.6 優(yōu)化條件下的表達(dá)規(guī)模擴(kuò)增 - 60 -
4.2.7 純化蛋白的透析與蛋白濃度的測(cè)定 - 63 -
4.3 討論 - 64 -
4.3.1 大腸桿菌融合性表達(dá)重組EGF - 64 -
4.3.2 原核表達(dá)蛋白的純化 - 66 -
4.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)條件的調(diào)整 - 68 -
4.3.4 重組EGF序列突變位點(diǎn)的分析 - 69 -
4.4 小結(jié) - 69 -
第五章 EGF Y13G突變體的獲得、EGF的pET28a重組表達(dá)與樣品的圓二色譜分析 - 71 -
5.1 材料與方法 - 71 -
5.1.1 材料 - 71 -
5.1.2 方法 - 72 -
5.2 結(jié)果與分析 - 75 -
5.2.1 pET28a-EGF重組表達(dá)條件的優(yōu)化 - 75 -
5.2.2 純化蛋白樣品的圓二色譜測(cè)定分析 - 78 -
5.3 討論 - 79 -
5.3.1 pET28a重組表達(dá)EGF - 79 -
5.3.2 圓二色譜檢測(cè)EGF二級(jí)結(jié)構(gòu) - 80 -
5.4 小結(jié) - 81 -
第六章 總結(jié)與展望 - 82 -
6.1 總結(jié) - 82 -
6.2 展望 - 82 -
縮略詞表 - 84 -
參考文獻(xiàn) - 86 -
致 謝 - 93 -




表皮生長(zhǎng)因子體外定向進(jìn)化及對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究

生物化學(xué)與分子生物學(xué)

摘要

人表皮生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor，hEGF)發(fā)現(xiàn)于1962 年，是一種由53 個(gè)氨基酸殘基組成的單體多肽。已證實(shí)hEGF 是一種關(guān)鍵性的創(chuàng)傷愈合因子，通過(guò)與其受體的結(jié)合，它能對(duì)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的致分裂作用；能促進(jìn)皮膚、角膜、肺和氣管上皮組織等的增殖和分化；對(duì)表皮損傷和潰瘍具有卓越修復(fù)功能；臨床上對(duì)腸、胃、肝等器官表面損傷的修復(fù)和再生也有顯著療效?？傊?，hEGF在醫(yī)療、美容護(hù)膚等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。
但是由于其自身半衰期較短等不利因素，至今尚未得到廣泛的使用，利用分子手段將它進(jìn)行改造已成為必然。針對(duì)EGF的三維結(jié)構(gòu)已比較清楚但結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系并不清楚而且EGF分子本身很小不利于改組的情況，本研究采用易錯(cuò)PCR和StEP聯(lián)合的方法將hEGF和pEGF的DNA進(jìn)行分子定向進(jìn)化。通過(guò)多次嘗試，探索了簡(jiǎn)便、有效、優(yōu)化的EGF體外定向進(jìn)化的技術(shù)路線，構(gòu)建了定向進(jìn)化文庫(kù)，用SSCP初步檢測(cè)文庫(kù)突變率可以達(dá)到其它大分子改組的水平。然后將突變文庫(kù)構(gòu)建成噬菌體展示文庫(kù)，通過(guò)活細(xì)胞噬菌體展示、ELISA和MTT的方法篩選到活性增強(qiáng)的突變體EGF26，為EGF體外定向進(jìn)化提供可借鑒經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)測(cè)序我們發(fā)現(xiàn)了其突變?yōu)?0Glu→Val，為了解這一突變引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，對(duì)EGF26和hEGF進(jìn)行了圓二色譜的檢測(cè)，并分析了這些變化對(duì)EGF活性增強(qiáng)的貢獻(xiàn)，為了解EGF結(jié)構(gòu)與功能之間聯(lián)系打開(kāi)新的視角。
此外，本研究構(gòu)建了pET32a(+)-EGF26 重組質(zhì)粒，以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的pET32a(+)-hEGF為對(duì)照，用BL21為宿主菌進(jìn)行融合表達(dá)。通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化最終確定在37℃，菌液初始OD600=0.5，IPTG 0.5mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間6 小時(shí)的條件下EGF得到最高的溶解性表達(dá)，而且使用金屬螯合親和層析純化后結(jié)果表明，EGF26的溶解性表達(dá)優(yōu)于hEGF，為EGF26的最終應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：表皮生長(zhǎng)因子 定向進(jìn)化 噬菌體展示 CD譜 溶解性表達(dá) 二級(jí)結(jié)構(gòu)