【摘要】 目的 研究誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)在中性粒細(xì)胞淋球菌感染模型中的表達(dá)。方法 分離正常人外周血中性粒細(xì)胞，在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液上培養(yǎng)3 h，A組加入空白培養(yǎng)基，B組加入淋球菌菌液，隨后在0、3、8、12 h分別以實(shí)時(shí)定量熒光PCR測(cè)定iNOS mRNA表達(dá)，用鎘還原法檢測(cè)NO濃度。結(jié)果 B組中iNOS mRNA表達(dá)和NO水平均較A組升高(P<0.01)，NO濃度在8 h達(dá)到高峰。結(jié)論 中性粒細(xì)胞淋球菌感染模型可成功模擬該菌體內(nèi)微氧感染環(huán)境，可用于研究淋球菌致病機(jī)制。

　　【關(guān)鍵詞】 淋球菌;中性粒細(xì)胞;一氧化氮

　　Establishment of gonococcus?induced neutrophil infection model

　　CHEN Rong?yi, ZHANG Guo?xue, CHEN Lei, FAN Yi?ming, WU Zhi?hua (Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

　　Abstract:Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in gonococcus?induced neutrophil infection model. Methods Peripheral blood neutrophils were islolated from health men, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 3 h. Blank medium or gonococcal inocula was added into group A or group B. NO concentration and iNOS mRNA expression at 0, 3, 8 and 12 h were determined by cadmium reduction method and real?time quantitative fluorescent PCR, respectively.Results Compared with group A, iNOS mRNA expression and NO level increased obviously in group B (P<0.01), and NO content peaked at 8 h.Conclusion The gonococcus?induced neutrophil infection model can simulate the micro?oxygen infection circumstance in vivo, and is suitable for studying the pathogenic mechanism of gonococcus.

　　Key words: gonococcus; neutrophil; nitric oxide

　　淋球菌為兼性厭氧的革蘭陰性雙球菌，可引起生殖系統(tǒng)急性化膿性炎癥，膿性分泌物中存在大量中性粒細(xì)胞[1]。中性粒細(xì)胞是一種專職吞噬細(xì)胞，感染初期可在炎癥介質(zhì)的介導(dǎo)下聚集在病灶處，通過吞噬攝入致病菌[2]。中性粒細(xì)胞殺傷吞噬微生物的機(jī)制包括活性氧簇、抗菌蛋白、一氧化氮(NO)等[3]。盡管中性粒細(xì)胞在淋球菌感染初期可迅速聚集到病灶，但淋病的遷延不愈表明中性粒細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)不足以徹底清除淋球菌。中性粒細(xì)胞可殺滅大部分吞噬的細(xì)菌(如大腸桿菌)，但部分淋球菌可在中性粒細(xì)胞內(nèi)生存甚至繁殖[4?5]。淋球菌是如何實(shí)現(xiàn)免疫逃逸并得以在中性粒細(xì)胞內(nèi)生存的問題目前尚未完全闡明。本研究擬建立中性粒細(xì)胞淋球菌感染模型，觀察NO和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，旨在將其用于研究淋球菌致病機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 淋球菌菌株

　　淋球菌株ST2951用WGC淋球菌專用培養(yǎng)基培養(yǎng)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢生物制品研究所)制備成OD600值為0.15的細(xì)菌懸液。

　　1.2 外周血中性粒細(xì)胞的分離

　　6名健康成年男性分別抽取2 mL肝素抗凝靜脈血，取抗凝血與Hank液混勻后小心加入到人中性粒細(xì)胞分離液中(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，LTS?1087)，18℃、2000 r/min離心20 min，待離心管由上至下分4層;吸取第3層(中性粒細(xì)胞)加入到含Hank液15 mL的試管中，充分混勻，2000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀反復(fù)洗滌2次，再用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞(1×107/mL);充分混勻后滴入細(xì)胞培養(yǎng)板中，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3 h備用。取少量細(xì)胞液涂片，作臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)，鑒定其存活率。

　　1.3 中性粒細(xì)胞淋球菌感染模型的建立

　　取出培養(yǎng)板，A組每孔加入含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液150μL，B組每孔滴入淋球菌懸液150μL;加樣完畢后繼續(xù)孵育，按0、3、8、12 h時(shí)間點(diǎn)在培養(yǎng)孔中吸出培養(yǎng)液作相應(yīng)檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

　　1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)iNOS mRNA含量

　　用Trizol溶液(美國(guó)GIBCO公司)提取中性粒細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)符合純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)GeneBank序列設(shè)計(jì)iNOS、β?actin引物，序列見表1。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃ 延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光染料(美國(guó)Biotium公司)技術(shù)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算機(jī)分析Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到系統(tǒng)認(rèn)為有目的DNA合成時(shí)的循環(huán)數(shù)，以陰性對(duì)照作參考)。表1 引物序列

　　1.5 NO濃度檢測(cè)