【摘要】 目的 研究誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)在中性粒細胞淋球菌感染模型中的表達。方法 分離正常人外周血中性粒細胞，在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液上培養(yǎng)3 h，A組加入空白培養(yǎng)基，B組加入淋球菌菌液，隨后在0、3、8、12 h分別以實時定量熒光PCR測定iNOS mRNA表達，用鎘還原法檢測NO濃度。結果 B組中iNOS mRNA表達和NO水平均較A組升高(P<0.01)，NO濃度在8 h達到高峰。結論 中性粒細胞淋球菌感染模型可成功模擬該菌體內微氧感染環(huán)境，可用于研究淋球菌致病機制。

　　【關鍵詞】 淋球菌;中性粒細胞;一氧化氮

　　Establishment of gonococcus?induced neutrophil infection model

　　CHEN Rong?yi, ZHANG Guo?xue, CHEN Lei, FAN Yi?ming, WU Zhi?hua (Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

　　Abstract:Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in gonococcus?induced neutrophil infection model. Methods Peripheral blood neutrophils were islolated from health men, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 3 h. Blank medium or gonococcal inocula was added into group A or group B. NO concentration and iNOS mRNA expression at 0, 3, 8 and 12 h were determined by cadmium reduction method and real?time quantitative fluorescent PCR, respectively.Results Compared with group A, iNOS mRNA expression and NO level increased obviously in group B (P<0.01), and NO content peaked at 8 h.Conclusion The gonococcus?induced neutrophil infection model can simulate the micro?oxygen infection circumstance in vivo, and is suitable for studying the pathogenic mechanism of gonococcus.

　　Key words: gonococcus; neutrophil; nitric oxide

　　淋球菌為兼性厭氧的革蘭陰性雙球菌，可引起生殖系統(tǒng)急性化膿性炎癥，膿性分泌物中存在大量中性粒細胞[1]。中性粒細胞是一種專職吞噬細胞，感染初期可在炎癥介質的介導下聚集在病灶處，通過吞噬攝入致病菌[2]。中性粒細胞殺傷吞噬微生物的機制包括活性氧簇、抗菌蛋白、一氧化氮(NO)等[3]。盡管中性粒細胞在淋球菌感染初期可迅速聚集到病灶，但淋病的遷延不愈表明中性粒細胞引起的炎癥反應不足以徹底清除淋球菌。中性粒細胞可殺滅大部分吞噬的細菌(如大腸桿菌)，但部分淋球菌可在中性粒細胞內生存甚至繁殖[4?5]。淋球菌是如何實現(xiàn)免疫逃逸并得以在中性粒細胞內生存的問題目前尚未完全闡明。本研究擬建立中性粒細胞淋球菌感染模型，觀察NO和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，旨在將其用于研究淋球菌致病機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 淋球菌菌株

　　淋球菌株ST2951用WGC淋球菌專用培養(yǎng)基培養(yǎng)(購自中國科學院武漢生物制品研究所)制備成OD600值為0.15的細菌懸液。

　　1.2 外周血中性粒細胞的分離

　　6名健康成年男性分別抽取2 mL肝素抗凝靜脈血，取抗凝血與Hank液混勻后小心加入到人中性粒細胞分離液中(天津灝洋生物制品科技有限公司，LTS?1087)，18℃、2000 r/min離心20 min，待離心管由上至下分4層;吸取第3層(中性粒細胞)加入到含Hank液15 mL的試管中，充分混勻，2000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀反復洗滌2次，再用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細胞(1×107/mL);充分混勻后滴入細胞培養(yǎng)板中，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3 h備用。取少量細胞液涂片，作臺盼藍拒染實驗，鑒定其存活率。

　　1.3 中性粒細胞淋球菌感染模型的建立

　　取出培養(yǎng)板，A組每孔加入含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液150μL，B組每孔滴入淋球菌懸液150μL;加樣完畢后繼續(xù)孵育，按0、3、8、12 h時間點在培養(yǎng)孔中吸出培養(yǎng)液作相應檢測，每組設3個復孔。

　　1.4 實時熒光定量PCR檢測iNOS mRNA含量

　　用Trizol溶液(美國GIBCO公司)提取中性粒細胞總RNA，經紫外分光光度計檢測符合純度后逆轉錄為cDNA，再進行實時熒光定量PCR檢測。根據GeneBank序列設計iNOS、β?actin引物，序列見表1。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃ 延伸20 s，共40個循環(huán)。應用SYBR GreenⅠ熒光染料(美國Biotium公司)技術行實時定量PCR反應，獲取各組標本的標準曲線，計算機分析Ct值(每個反應管內熒光強度達到系統(tǒng)認為有目的DNA合成時的循環(huán)數，以陰性對照作參考)。表1 引物序列

　　1.5 NO濃度檢測