多糖－蛋白結(jié)合疫苗與核酸佐劑的研制及免疫特性研究
頁(yè)數(shù) 66 字?jǐn)?shù) 39906
摘要
此為碩士研究論文
特異性多糖疫苗在抗病原體感染，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮了重要的作用。然而，多糖是T細(xì)胞非依賴型抗原，在體內(nèi)不能產(chǎn)生免疫記憶，對(duì)免疫功能低下者無(wú)明顯作用。新型多糖－蛋白結(jié)合疫苗能在體內(nèi)激活T細(xì)胞，改善多糖疫苗的功能，成為新型疫苗的研發(fā)熱點(diǎn)。
本工作研究了多糖－蛋白結(jié)合疫苗的制備方法和對(duì)多糖抗原免疫原性的保護(hù)措施。采用雙環(huán)氧試劑1,4-二丁醇二縮水甘油醚進(jìn)行肺炎球菌莢膜多糖與蛋白BSA的結(jié)合?？疾炝饲v膜多糖/結(jié)合試劑配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等制備條件與莢膜多糖活化度的關(guān)系，建立了過(guò)程可控、質(zhì)量可控的制備工藝。通過(guò)嚴(yán)格控制制備條件，可有效地將莢膜多糖活化度控制在所需的數(shù)量級(jí)。
對(duì)不同活化度莢膜多糖的免疫原性研究結(jié)果表明，活化度的增加導(dǎo)致多糖免疫原性減弱。當(dāng)多糖活化度低于10時(shí)，可有效地保持多糖的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)制備的莢膜多糖－蛋白的結(jié)合物中，相同多糖用量情況下，蛋白用量的增加能夠促進(jìn)血清中抗多糖抗體類型由IgM向IgG轉(zhuǎn)變，分別提高結(jié)合物抗多糖、抗蛋白IgG抗體滴度。
本工作分別從肺炎球菌和大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化DNA，采用超聲波對(duì)所提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行物理降解，制備成大分子量（約21000bp）和小分子量（約400bp）的DNA佐劑。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌DNA佐劑使用安全，本實(shí)驗(yàn)中大劑量腹腔注射未見小鼠有不良反應(yīng)。小分子量DNA佐劑的免疫增強(qiáng)作用弱于大分子量DNA佐劑，DNA分子在體內(nèi)的降解可能是其重要原因。采用氫氧化鋁膠體吸附可使其在體內(nèi)緩釋，極顯著地提高DNA佐劑的免疫增強(qiáng)作用。
研究了不同佐劑對(duì)多糖抗原、蛋白抗原和多糖－蛋白結(jié)合物抗原的免疫增強(qiáng)作用。氫氧化鋁佐劑能增加多糖－蛋白結(jié)合物誘生的抗多糖IgG抗體滴度，極其顯著地增加抗蛋白及抗結(jié)合物自身的IgG抗體滴度。細(xì)菌DNA佐劑的整體免疫增強(qiáng)作用弱于氫氧化鋁佐劑，但其能在體內(nèi)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，使IgG2a/IgG1比值上升，激活免疫細(xì)胞殺滅病原體。
以體外培養(yǎng)的脾細(xì)胞為模型，研究添加佐劑后脾細(xì)胞活性和TLR－9蛋白表達(dá)量的變化。體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性。提示脾細(xì)胞體外培養(yǎng)模型有可能作為佐劑篩選和佐劑作用機(jī)理研究的一種手段。
本研究對(duì)莢膜多糖－BSA結(jié)合疫苗制備及免疫原性和對(duì)DNA佐劑制備及免疫增強(qiáng)作用的研究結(jié)果對(duì)于下階段新型肺炎球菌莢膜多糖－外膜蛋白結(jié)合疫苗的研發(fā)提供了重要依據(jù)。
關(guān)鍵詞：莢膜多糖，蛋白，結(jié)合疫苗，細(xì)菌DNA，佐劑，脾細(xì)胞



目 錄
第一章 引 言 1
1.1 疫苗 1
1.1.1 多糖疫苗 1
1.1.2 蛋白疫苗 2
1.1.3 多糖－蛋白結(jié)合疫苗 2
1.1.4 抗肺炎球菌感染類疫苗 3
1.1.4.1 肺炎球菌 3
1.1.4.2 肺炎球菌的多糖疫苗 4
1.1.4.3 肺炎球菌的多糖－蛋白結(jié)合疫苗 4
1.2 多糖－蛋白結(jié)合疫苗的制備技術(shù) 5
1.2.1 結(jié)合疫苗制備技術(shù)的要求 6
1.2.2 雙環(huán)氧試劑結(jié)合法 6
1.3 佐劑 7
1.3.1 佐劑的作用 7
1.3.2 佐劑誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答方式 8
1.3.3 傳統(tǒng)佐劑 9
1.3.3.1 福氏佐劑 9
1.3.3.2 含鋁佐劑 9
1.3.4 CpG 佐劑 10
1.3.4.1 CpG 佐劑的免疫機(jī)制 10
1.3.4.2 CpG 佐劑的構(gòu)效關(guān)系 12
1.3.4.3 CpG 佐劑的應(yīng)用 14
1.3.4.4 CpG佐劑的前景 14
1.4 本工作的主要研究?jī)?nèi)容與主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) 16
1.4.1 主要研究?jī)?nèi)容 16
1.4.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) 16
第二章 多糖－蛋白結(jié)合疫苗制備及免疫原性研究 17
2.1 材料 17
2.1.1菌種 17
2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 17
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 17
2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)藥品 17
2.1.5 培養(yǎng)基 18
2.2 方法 18
2.2.1 肺炎球菌莢膜多糖的分離純化 18
2.2.1.1 肺炎球菌的培養(yǎng) 18
2.2.1.2 粗多糖的制備 18
2.2.1.3 離子交換層析法純化莢膜多糖 18
2.2.2 莢膜多糖－蛋白結(jié)合物的制備 19
2.2.3 檢測(cè)方法 19
2.2.3.1 多糖含量檢測(cè) 19
2.2.3.2 蛋白質(zhì)含量的檢測(cè) 19
2.2.3.3 活化多糖上活性結(jié)合基團(tuán)數(shù)目的測(cè)定 20
2.2.3.4 SDS-PAGE電泳檢測(cè) 20
2.2.3.5 HPLC檢測(cè) 21
2.2.4 免疫原性的研究 22
2.2.4.1 小鼠免疫 22
2.2.4.2 抗體滴度的ELISA檢測(cè)（間接法） 22
2.2.4.3 數(shù)據(jù)分析 22
2.3 結(jié)果與討論 23
2.3.1 莢膜多糖的制備 23
2.3.2 肺炎球菌6B型莢膜多糖的特性鑒定 24
2.3.3 多糖－蛋白結(jié)合方法研究 24
2.3.3.1 多糖蛋白結(jié)合物的制備 24
2.3.3.2 結(jié)合產(chǎn)物的HPLC分析 25
2.3.3.3 多糖－蛋白結(jié)合產(chǎn)物的電泳分析 28
2.3.4 結(jié)合試劑用量與多糖活化時(shí)間對(duì)多糖活化度的影響 29
2.3.5 不同活化度對(duì)多糖的免疫原性的影響 29
2.3.6 不同多糖：蛋白結(jié)合比例結(jié)合物的制備及免疫原性研究 30
2.3.7 不同佐劑對(duì)多糖-蛋白結(jié)合物的免疫增強(qiáng)作用 33
2.4 小結(jié) 36
第三章 核酸佐劑的制備與免疫增強(qiáng)作用研究 37
3.1 材料 37
3.1.1菌種 37
3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 37
3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 37
3.1.4 主要實(shí)驗(yàn)藥品 37
3.2 方法 38
3.2.1 細(xì)菌總DNA的提取和純化 38
3.2.2 提取DNA純度的檢測(cè) 38
3.2.3 佐劑的制備 39
3.2.3.1 DNA 佐劑的制備 39
3.2.3.2 氫氧化鋁佐劑的制備 39
3.2.3.3 合成佐劑CPG－ODN的制備 39
3.2.3.4 混合佐劑的制備 39
3.2.4 佐劑免疫增強(qiáng)作用的考察 39
3.2.4.1小鼠免疫實(shí)驗(yàn) 39
3.2.4.2 體外小鼠脾細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn) 39
3.3 結(jié)果與討論 41
3.3.1 細(xì)菌總DNA的提取制備 41
3.3.2 提取DNA的特征分析 41
3.3.2.1 紫外掃描 41
3.3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳 42
3.3.3 DNA佐劑對(duì)BSA抗原的免疫增強(qiáng)作用 43
3.3.3.1 大分子量DNA佐劑的免疫增強(qiáng)作用 43
3.3.3.2 小分子量DNA佐劑對(duì)BSA的免疫增強(qiáng)作用 44
3.3.4 DNA佐劑和其它佐劑對(duì)BSA抗原的免疫增強(qiáng)作用 45
3.3.5 DNA佐劑對(duì)小鼠脾細(xì)胞的刺激作用 46
3.3.6 DNA佐劑對(duì)TLR-9受體表達(dá)的增強(qiáng)作用 48
3.3.7 DNA佐劑和氫氧化鋁佐劑對(duì)多糖抗原的免疫增強(qiáng)作用 49
3.3.8 不同佐劑對(duì)不同抗原的免疫增強(qiáng)作用 50
3.4 小結(jié) 51
第四章 結(jié)論與展望 52
4.1 結(jié)論 52
4.2 展望 53
參考文獻(xiàn) 54
致 謝 60


參考文獻(xiàn)
[1]張欠欠,惠清發(fā),趙學(xué)忠.疫苗研制及應(yīng)用的研究現(xiàn)狀與展望.延安大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005, 24(4):78.
[2]董德祥主編.疫苗技術(shù)基礎(chǔ)與應(yīng)用.北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2002.
[3]劉純杰.疫苗研制技術(shù)的現(xiàn)狀與展望.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2002,30(3):6264.
[4]董群,方積年.多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用.中國(guó)藥學(xué)雜志,2001,36(10):649.
[5]翟少欽,左之才.生物多糖免疫作用的研究進(jìn)展及應(yīng)用.中獸醫(yī)學(xué)雜志, 2001,(3):2