芋螺毒素MVIIA在大腸桿菌中的表達與純化

1.3萬字 30頁 原創(chuàng)作品，已通過查重系統(tǒng)

摘 要
芋螺毒素是海洋動物芋螺的毒液管和毒腺所分泌的一類具特異生物活性的小肽神經(jīng)毒素。其中ω-MVIIA是一種有效并且特異性很高的神經(jīng)元N-型電壓敏感性鈣通道阻滯劑，具有鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護作用。由于ω-MVIIA在藥理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)研究等方面具有非常重要的意義，近年來對芋螺毒素的需求大幅度增加，而直接從芋螺中提取芋螺毒素遠遠滿足不了現(xiàn)實需求。因此，本研究擬利用基因工程方法在大腸桿菌中高效表達具有生物學(xué)活性的芋螺毒素-MVIIA。
本文利用PCR技術(shù)從pUC18-MVIIA上擴增經(jīng)密碼子優(yōu)化的MVIIA基因，用BamHI、HindIII雙酶切后連入原核表達載體pET32a，得到重組質(zhì)粒pET32-MVIIA，測序表明重組質(zhì)粒上的MVIIA基因序列完全正確。將重組質(zhì)粒pET32-MVIIA轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami B菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，采用SDS-PAGE技術(shù)可檢測到重組MVIIA的表達（約24kDa）。進而利用溶菌酶結(jié)合超聲波破碎細胞，使用鎳離子親和樹脂從細胞破碎液分離重組MVIIA，經(jīng)透析、冷凍干燥后，溶解于生理鹽水。采用BCA法對重組MVIIA進行定量，其濃度為0.38 mg/mL。按5 mg/Kg劑量，在小鼠腹腔中注射純化的重組MVIIA，進行醋酸扭體試驗，與注射生理鹽水的對照組相比，注射重組MVIIA的小鼠無任何扭體現(xiàn)象，這表明重組芋螺毒素具有鎮(zhèn)痛活性。本研究為利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)芋螺毒素提供了依據(jù)。


關(guān)鍵詞：芋螺毒素MVIIA；大腸桿菌；基因工程；鎮(zhèn)痛活性